OSTEXOMAR® NTX Urine 試劑盒說明書（cat#9006）

酶聯(lián)免疫吸附法（EIA）定量檢測人尿液中I型膠原交聯(lián)氨基末端肽（NTX）

產(chǎn)品應(yīng)用：

Osteomark 用于定量測定分泌的交聯(lián)型I型膠原N端肽（NTX）。NTX是骨吸收的一種標(biāo)記物，尿液NTX水平的升高標(biāo)志著骨吸收水平的升高。NTX的測量用于以下用途：

A．預(yù)測絕經(jīng)后婦女用激素抗吸收治療的骨骼反應(yīng)（骨密度）。

B．治療監(jiān)測

1． 絕經(jīng)后婦女的抗吸收治療

2． 診斷為骨質(zhì)疏松癥人群的抗吸收治療

3． 診斷為佩吉特骨病人群（Paget’s Disease）的抗吸收治療

4． 雌激素治療監(jiān)測

C．發(fā)現(xiàn)對于絕經(jīng)婦女補(bǔ)鈣和激素治療一年后骨密度下降的可能性。

Osteomark 的檢測范圍是20~3000nM骨膠原當(dāng)量（BCE）

實(shí)驗(yàn)說明：

哺乳動物通過破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，伴隨由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成的連續(xù)過程，而不斷的重建，這個(gè)過程對骨骼的正常發(fā)育和維持是必須的，這個(gè)緊密結(jié)合的過程的異常往往導(dǎo)致骨量和形狀的改變。對特異的骨降解產(chǎn)物的測定，可以作為研究骨代謝率提供分析數(shù)據(jù)。

約90%的骨組織基質(zhì)是I型膠原，I型膠原是一種由C端和N端交聯(lián)的螺旋蛋白，這種蛋白組成了骨組織的基本結(jié)構(gòu)和張力。NTX(交聯(lián)型I型膠原C末端肽)的發(fā)現(xiàn)為骨吸收提供了一種特異的生化標(biāo)記物，這種標(biāo)記物可用于免疫檢測。NTX作為骨檢測特性分子，是由于其氨基酸序列和a2端肽的結(jié)構(gòu)方向。NTX分子的產(chǎn)生是由骨中破骨細(xì)胞介導(dǎo)的，作為一種穩(wěn)定的降解終產(chǎn)物存在于尿液中。

OSTEXOMAR®試劑盒用于定量測定尿液中的NTX。尿液中NTX水平的升高標(biāo)志著骨吸收水平的升高。骨吸收水平的升高是與年齡相關(guān)的骨量降低的首要原因。低骨量常常導(dǎo)致骨量減少，是骨質(zhì)疏松的主要原因。當(dāng)骨吸收水平高于骨形成水平時(shí)骨量降低。據(jù)報(bào)道，骨質(zhì)疏松性骨折是老年婦女發(fā)病率和死亡率升高的主要原因。

對接受激素治療（HRT）和補(bǔ)鈣（500mg/ 天）或僅進(jìn)行補(bǔ)鈣的絕經(jīng)婦女進(jìn)行了一次隨機(jī)、前瞻性的臨床試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果支持用Osteomark的試劑盒預(yù)測的反應(yīng)和監(jiān)測抗吸收治療的效果。

用OSTEXOMAR®試劑盒監(jiān)測抗吸收治療的應(yīng)用，在一項(xiàng)用雙磷酸鹽（alendronate sodium, 10 mg）治療骨質(zhì)疏松病人的研究中得到了陳述。結(jié)果表明骨質(zhì)疏松病人在經(jīng)過三個(gè)月的治療后，其Osteomark值應(yīng)被控制在≤35 NM BCE/mM肌酐或者經(jīng)過3個(gè)月的治療后≥40%偏離于基線。

為了測定Osteomark試劑盒在監(jiān)測佩吉特骨病人（Paget’s Disease）抗吸收治療效果的能力，進(jìn)行了一項(xiàng)研究。Osteomark試劑盒基線值于治療開始后于基線的變化率都于血清堿性磷酸酶總量相關(guān)。在治療效果上，Osteomark試劑盒檢測值用于早期治療后的早期評估。抗吸收治療三個(gè)月后，佩吉特骨病人（Paget’s Disease）應(yīng)偏離基值30%以上。

檢測原理：

OSTEXOMAR®試劑盒采用競爭法測定，用包被有NTX的微孔為固相，標(biāo)本中的NTX和固相中的NTX競爭結(jié)合HRP標(biāo)記的NTX單克隆抗體。結(jié)合到固相上的抗體的量和結(jié)合到標(biāo)本中的NTX的抗體量成反比。標(biāo)本中NTX的濃度通過吸光度發(fā)測定。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出。稀釋的尿液測定通過肌酐分析校正，用nMBCE/mmol 肌酐/L表示。

試劑盒組成：

試劑說明：

96孔板： 96孔（12x8）可拆板，包被有合成的NTX。

抗體：1瓶，純化的小鼠NTX單抗-HRP標(biāo)記（含保護(hù)劑）。100X濃縮液（0.4ml）

抗體稀釋液：1瓶，用于抗體稀釋（含保護(hù)劑）30ml。

30X洗液：30x濃縮洗液。

顯色劑：100x濃縮液（0.9ml）

底物緩沖液：過氧化氫緩沖液 (30ml)

終止液：1瓶，1N硫酸（25ml）

標(biāo)準(zhǔn)品：分析用標(biāo)準(zhǔn)品：1,30,100,300,1000,3000nM BCE（各0.4ml）。

質(zhì)控品：尿液質(zhì)控品I，II，各一管。

試劑保存：

試劑2-8℃保存，用前置于室溫平衡。不要將試劑置于30℃或者2℃以下環(huán)境中，稀釋后的洗滌液可在室溫存放1個(gè)月。

試劑盒不提供的設(shè)備/試劑：

1） 移液器

2） 槍頭

3） 塑料容器

4） 自動洗板機(jī)

5） 酶標(biāo)儀

6） 曲線擬合軟件

7） 去離子水

尿標(biāo)本的收集保存：

1） 收集早晨的第二次晨尿或者24小時(shí)尿標(biāo)本，盛于密閉容器中。

2） 尿標(biāo)本中不要加保護(hù)劑

3） 帶血標(biāo)本或溶血標(biāo)本可能對測定造成影響，建議重新采集樣本。

4） 尿標(biāo)本2-8℃可以保存72小時(shí)，室溫可保存24小時(shí)，冷凍（≤20℃）可長期保存，避免反復(fù)凍融。

5） 監(jiān)測治療時(shí)，基準(zhǔn)標(biāo)本應(yīng)該在治療開始前收集，后續(xù)收集的用于比較治療效果的標(biāo)本收集的時(shí)間應(yīng)與基準(zhǔn)標(biāo)本收集的時(shí)間一致。

注意事項(xiàng)

1） 僅供體外診斷用

2） 96孔板、標(biāo)準(zhǔn)品和尿液質(zhì)控品匯總含有從人尿液或骨組織提取的抗原，應(yīng)做適當(dāng)處理。

3） 終止液中含有1N硫酸，不要濺到皮膚或眼睛中。一旦被濺到，立即用水沖洗15分鐘，濺如如眼睛時(shí)要立即就醫(yī)。

4） 顯色幾種含有TMB和DMSO。DMSO易被皮膚吸收，吸入、寄出皮膚或吞咽多會造成傷害，一旦暴露，應(yīng)立即用流水沖洗暴露部位15 分鐘，如濺入眼中，立即就醫(yī)。

5） 尿液標(biāo)本中可能含有傳染源，應(yīng)做正確處理，用0.5%的次氯酸鈉溶液或121℃高壓消毒1小時(shí)。不要高壓次氯酸鈉的溶液，也不要將次氯酸鈉和酸混合。

6） 決不要用嘴吸試劑或臨床標(biāo)本。

7） 處理標(biāo)本和試劑時(shí)要穿防護(hù)衣，戴防護(hù)手套，用完后洗手。

8） 不要使用過效期試劑。

9） 不要將不同批號的試劑混合使用。

10）微孔板必須干燥保存，未使用的板條應(yīng)當(dāng)用盛有干燥劑的密封袋重新密封保存。

11）測定程序要在符合溫育要求的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中進(jìn)行，測試中要避開特殊的環(huán)境條件。

操作流程：

1.    測定前至少將標(biāo)本和試劑盒在室溫（18-28℃）平衡1小時(shí)。為了偏于加溫，將試劑從世紀(jì)合眾取出，冰凍狀態(tài)的尿標(biāo)本，可用水浴或溫育箱37℃解凍后，置于室溫。顯色幾種含有DMSO,冷凍后是有可能是固體，室溫狀態(tài)下是液體。

2.    制備1X的洗滌液。將30X的洗滌液用去離子水1:30稀釋（1份30X濃縮洗滌液+29份去離子水）。至少混勻5分鐘，稀釋后的洗滌液在室溫可保存1個(gè)月 。

3.    做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和尿標(biāo)本位置的孔排布圖。建議標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和尿標(biāo)本都做復(fù)孔，以下是測試4例樣本的排布圖。

4.    準(zhǔn)備一個(gè)一次性塑料容器,用抗體稀釋液1:101稀釋濃縮抗體。對于整塊板，建議：

取20ul的抗體濃縮液用2ml的抗體稀釋液去稀釋，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，不要渦旋混勻或用磁力攪拌。配好的抗體稀釋液1小時(shí)使用，容器不要重復(fù)使用。

5.    測定前輕輕混勻標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和尿液標(biāo)本，不要形成泡沫。混濁樣本放置5-10分鐘再吸樣，含沉淀的尿標(biāo)本，用前請離心。

6.    取出需要數(shù)量板條，剩余放回密封袋，沿拉鏈密封，保留干燥劑。

標(biāo)本和抗體的孵育（測試開始后，不要間斷）

7．根據(jù)步驟3種的孔排布，加入25ul的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、尿液標(biāo)本于相應(yīng)的微量孔中。

  加樣槍用前校準(zhǔn)，每次家養(yǎng)后需要換新的吸頭。

8.用排槍加入200ul的稀釋后的抗體，用封板膜封板，在平面上輕輕混勻5-10秒。

9.    室溫（18-28℃）孵育90±5分鐘。

10.  在溫育后的最后10min準(zhǔn)備顯色底物溶液，將顯色液（Chromogen）加入底物緩沖液（Buffered Subsrate）中。建議，如果是整版的，去20ul顯色液加入到2ml的底物緩沖液中。底物緩沖液加到一個(gè)一次性塑料容器中，將顯色液充分混勻后加到底物溶液中，輕輕混勻，不要?jiǎng)×覔u動或使用磁力攪拌。配置的顯色底物緩沖液要在30分鐘內(nèi)使用。混勻后溶液應(yīng)當(dāng)是無色的，藍(lán)色表明試劑被污染，應(yīng)當(dāng)棄掉。配置顯色底物緩沖液的容器不可重復(fù)利用。

11.  溫育結(jié)束，小心揭去密封條，在自動洗板機(jī)上用洗液洗板5次，每次沖洗循環(huán)沒空最少350ul洗液。洗板過程中，每孔中應(yīng)加滿洗滌液。沖洗結(jié)束，倒置板，在吸水紙上排干。立即加入上述配好的顯色底物緩沖液。

顯色和測定

12.  用排槍取200ul第10步配置好的顯色底物緩沖液加入到各孔。用封板膜封板。

13.  室溫孵育15±1分鐘，結(jié)合有HRP標(biāo)記抗體的孔會有藍(lán)色顯色。

14.  孵育結(jié)束后，小心揭去封板膜。用排槍加入100ul終止液，孔內(nèi)顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。

15.  在平面上將微孔板輕輕旋轉(zhuǎn)混勻5-10秒，室溫繁殖5分鐘后測吸光度值。

16.  加入終止液后30分鐘內(nèi)，酶標(biāo)儀讀取標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控和樣本吸光度值。主波長450nm,副波長630nm，酶標(biāo)儀應(yīng)能保證最大OD≥3.0。

結(jié)果分析：

1.采用4參數(shù)曲線擬合的方式，做標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本和質(zhì)控的濃度值（nM BCE）。

2.結(jié)果在滿足以下條件下是有效的：

1）1nM BCE標(biāo)準(zhǔn)品的平均OD值必須≥1.5

2）1nM BCEE標(biāo)準(zhǔn)品OD值和3000NM BCE標(biāo)準(zhǔn)品OD值相差應(yīng)≥1.3

3）樣本復(fù)孔間的變異系數(shù)（CV%）應(yīng)≤20%。樣本，CV%≥20%的應(yīng)該重測。

4)檢測值20 nM BCE(不包括肌酐調(diào)整值)

5）樣本濃度超過3000nM BCE需要用200-500nm BCE的尿樣做1:5稀釋后再測。當(dāng)用樣本做稀釋液時(shí)，這個(gè)稀釋液的nm BCE也要在同一塊板上測定出來。稀釋倍數(shù)和背景（稀釋液的nm BCE值）也要合并計(jì)算。

例如：用測值是300nM BCE的尿液做稀釋液，以1:5的比例稀釋4000 nMBCE的樣本，測值為：1040nM BCE。

1040 nM BCE - (0.8 x 300 nM BCE) = 800 nM BCE

800 nM BCE x 5 (稀釋倍數(shù)) = 4000 nM BCE

注：1:5稀釋表示稀釋液（作為稀釋液的尿液中）的NTX 占20%

6） 檢測報(bào)告的測值用：nM BCE/ mM肌酐表示，例如：

測定值：360 nM BCE

尿肌酐值：60mg/dL肌酐/11.3（轉(zhuǎn)化因子）=5.3mM肌酐

360 nM BCE/5.3 mM肌酐=68 nM BCE/ mM肌酐

注：11.3(轉(zhuǎn)化因子)：將毫克/分升（dL）轉(zhuǎn)換為毫摩爾/L的轉(zhuǎn)化因子。

7.    廠家建立了自己的質(zhì)控范圍，建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室建立自己的質(zhì)控范圍。

局限性：

雖然NTX被用作骨吸收檢測標(biāo)記物，但尚未用于預(yù)測骨質(zhì)疏松癥的形成和未來發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)，也未用于診斷原發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、甲狀腺甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)。當(dāng)用該試劑盒監(jiān)測治療效果時(shí)，可能會受到影響骨吸收的其他臨床條件的影響。例如：骨轉(zhuǎn)移。由于報(bào)告結(jié)果不包含時(shí)間因素，單一的Osteomark值不能提供骨吸收率。其結(jié)果應(yīng)當(dāng)結(jié)合臨床和其他診斷結(jié)果綜合分析。

干擾物質(zhì)：

對尿液中各種可能對測定造成干擾的成份和微生物進(jìn)行了評估。已檢測微生物，如：大腸桿菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、白色假絲酵母菌（ATCC 14053）都對測定無干擾，人白蛋白、膽紅素、糖和維生素C對測定也無干擾。血尿標(biāo)本和溶血標(biāo)本可能對測定造成干擾，應(yīng)棄掉，重新采樣。

預(yù)測值

表1：男性和絕經(jīng)前婦女測值預(yù)期范圍

絕經(jīng)前婦女的預(yù)期值范圍經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后為：14-74nM BCE/mM肌酐

男性參考范圍為：13-78nM BCE/mM肌酐

從對健康絕經(jīng)后婦女（n=276,268）和30歲以上的男人（n=36,35）的研究中確立了短期和長期的變異。連續(xù)收集3-4天尿標(biāo)本測定短期變異，連續(xù)收集2-3個(gè)月尿標(biāo)本測定長期變異。短期變異：婦女15%， 男男子：18%。長期變異：婦女18%， 男性19%

重復(fù)性和精密度：

批內(nèi)差異：由4個(gè)操作者分別對8份尿液標(biāo)本重復(fù)測定10次而評估的。結(jié)果如下：

批間差異：由一個(gè)操作者對3分尿標(biāo)本重復(fù)測定20次，進(jìn)行評估，結(jié)果如下：

精密度：是通過30天中在3家臨床實(shí)驗(yàn)室測定尿液質(zhì)控品I和尿液質(zhì)控品II進(jìn)行評價(jià)的。尿液質(zhì)控品I的均值為439 nM BCE，變異系數(shù)為10%，尿液質(zhì)控品II的均值為1537 nM BCE，變異系數(shù)為7%。

抗原回收：

抗原回收是通過向3份已知NTX濃度的尿標(biāo)本中加入已知量的NTX來評價(jià)。回收表示測得值占理論值（尿液基準(zhǔn)值加新加入的抗原（NTX）值）的百分比，結(jié)果抗原回收率是105%。

線性檢測：

稀釋線性是通過對4分高nM BCE的尿液標(biāo)本用200-500 nM BCE的尿液標(biāo)本做系列稀釋來評價(jià)。結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)r=0.999 或 r=1.0000

注：中文譯文僅供參考，請以英文說明書為準(zhǔn)