FD Rapid GolgiStainTM Kit FD 快速高爾基染色試劑盒

神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究的完整 Golgi-Cox 染色試劑盒

使用手冊(cè)中文版

PK401/PK401A

      I.        介紹

Golgi-Cox 浸染法是研究神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞正常和非正常形態(tài)zui有效的方法之一。 使用 Golgi 技術(shù)，在藥物處理過的動(dòng)物腦中和因神經(jīng)疾病死亡的病人腦中發(fā)現(xiàn)了神經(jīng) 樹突和樹突微小的形態(tài)改變。然而 Golgi 染色法的不可靠性且費(fèi)時(shí)已成為這種方法廣泛應(yīng)用的障礙。

FD Rapid GolgiStainTM Kit(FD 快速高爾基染色法)是根據(jù) Ramón-Moliner，Glaser 和 Van der Loos 所闡述的方法原理設(shè)計(jì)的。該試劑盒不僅極大地改進(jìn)并簡(jiǎn)化了 Golgi-Cox 技術(shù)，而且被證實(shí)在顯示神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，尤其是樹突棘的形態(tài)細(xì)節(jié)極為靈敏 可靠。北京博蕾德生物代理的 FD Rapid GolgiStainTM Kit 已被廣泛用于并用于數(shù)種動(dòng) 物腦組織染色。

II.     試劑盒盒組分

III.  需要但未包括在試劑盒里的物品

1.     雙蒸水或 Milli-Q 水

      2.    塑料/玻璃管或瓶

  3.    組織學(xué)耗材： 明膠包被的顯微鏡載玻片（Cat.#PO101） 蓋玻片

 染色罐 乙醇 二甲苯

樹膠封片劑 Permount®

光學(xué)顯微鏡

IV.        安全操作注意事項(xiàng)

1.   FD Rapid GolgiStainTM Kit 僅用于體外研究，不能用于診斷或其它應(yīng)用。

2. 試劑盒所包含有試劑是有毒的，吸入或接觸皮膚是有害的，如果吞咽可能是致 命的。不要用嘴吸。避免吸入和接觸皮膚和眼睛。如果接觸，立即用大量的水 沖洗并求助醫(yī)生。

3. 在化學(xué)通風(fēng)櫥下完成實(shí)驗(yàn)。操作這些試劑時(shí)須穿戴合適的防護(hù)服，手套和眼睛 和面部防護(hù)罩，完成實(shí)驗(yàn)之后把手*沖洗干凈。

V.     組織制備

使用此試劑盒前必須仔細(xì)閱讀以下說明！！

l     所用容器（zui好為塑料材質(zhì)）必須用蒸餾水沖洗干凈。

l     當(dāng)溶液 A 和溶液 B 存在時(shí)不能使用金屬器具。

l     保持容器密封。

l     用溶液 A 和溶液 B 處理的組織和切片，應(yīng)該避光。

l     除非特別指出，以下流程需在室溫下完成。

1.    殺死動(dòng)物之前對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行深度麻醉。應(yīng)盡快地從顱骨中取出動(dòng)物的腦（或病人的腦），但操作時(shí)必須非常小心以免損傷或壓迫組織。

注意

l 除非*必要，不要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行灌注。如果確實(shí)需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行灌注（用4%的多聚甲醛處理不要超過 5 分鐘），一定不要對(duì)組織進(jìn)行后固定處理。

l  體積較大的腦部樣本包括大鼠腦部應(yīng)該用鋒利的刀片切成大約 10mm 厚的 塊狀。

重要提示！

2.    用雙蒸水或 Milli-Q 水快速?zèng)_掉組織表面的血液。

3.    把組織浸泡在由溶液 A 和 B 等體積混合的浸漬液中，室溫下黑暗保存兩周*。浸 泡 6 個(gè)小時(shí)以后或次日更換新的浸漬液。

*對(duì)于大多數(shù)情況浸泡 2 周是足夠的。然而，不同的組織類型及組織的大小不同 可能需要延長(zhǎng)或縮短浸泡時(shí)間來達(dá)到zui佳效果。對(duì)于每種類型的組織的浸泡時(shí) 間應(yīng)該通過試驗(yàn)獲得，但是對(duì)于大多數(shù)組織浸泡 3 周是足夠的。注意，延長(zhǎng)浸 泡時(shí)間可能增加染色背景

注意

l  溶液 A 和溶液 B 的混合液至少在用之前 24 小時(shí)配制，并不能攪拌。

l   采用以上方案則不會(huì)產(chǎn)生沉淀是關(guān)鍵的。

l   制備好的浸泡液在用之前室溫黑暗保存可長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月。

l   每 m3 待研究組織至少用 5ml 浸泡液。注意用較少的浸泡液可能降低染色 的靈敏性和可靠性。

l   為取得zui佳結(jié)果，在浸泡期間每周兩次對(duì)裝有組織的容器可輕輕地左右旋 渦（一定不要晃動(dòng)！）幾秒鐘溶液 A 和 B （含有升Hg，重鉻酸鉀和鉻酸鉀）接觸皮膚是有毒的，如果吞 咽可能是致命的。實(shí)驗(yàn)應(yīng)該在化學(xué)通風(fēng)櫥中完成。當(dāng)操作這些試劑時(shí)應(yīng)穿 戴防護(hù)服，手套和防護(hù)面具/眼鏡。不要把溶液 A 和 B 的廢棄物倒進(jìn)水槽中！ 把溶液 A 和 B 的廢棄物收集起來放到一個(gè)瓶子中，致電安全辦公室或有執(zhí) 照的專業(yè)廢物處理服務(wù)的部門處理些材料。

4.    轉(zhuǎn)移組織到溶液 C 中室溫黑暗至少 72 小時(shí)（可長(zhǎng)達(dá) 1 周）。24 小時(shí)后或次日至 少更換一次溶液。

5.    在-20℃到-22℃的條件下用冷凍切片機(jī)將組織切成 100-200  um 厚的薄片（進(jìn)行切片之前請(qǐng)仔細(xì)閱讀第 4 和 5 頁的信息）。也可用其它型號(hào)的顯微鏡薄片切片機(jī)包括滑動(dòng)切片機(jī)和振動(dòng)切片機(jī)（具體細(xì)節(jié)參看第 4 和 5 頁）。用樣本回收器（試 劑盒提供）把樣本轉(zhuǎn)移到含有溶液 C（試劑盒所提供的滴瓶是方便溶液 C 滴到載 玻片上）的明膠包被的顯微鏡載玻片上（Cat#PO101）。載玻片上多余的溶液用 吸管吸走并用濾紙吸干（載玻片上的溶液必須盡可能地吸干否則切片將從載玻 片上脫落下來）。切片可以室溫下自然風(fēng)干（不能用電風(fēng)扇或電熱板使其干燥）。 為取得zui佳結(jié)果，應(yīng)盡快地完成切片，制備好的切片如果保存于載玻片盒中， 室溫黑暗條件下zui長(zhǎng)可保存 3 天。

注意

l 為避免組織受冷凍切片機(jī)的損害，并盡可能地保持細(xì)胞形態(tài)學(xué)，組織在進(jìn) 行冷凍切片之前應(yīng)快速冰凍。比如，組織應(yīng)按以下描述盡可能地快速冰凍： 把組織放在一個(gè)塑料匙中慢慢地浸入含有干冰的異戊烷中預(yù)冷（為取得zui 佳結(jié)果，溫度應(yīng)保持在-70℃以下并且浸入過程用時(shí) 1 分鐘，越慢越好）。組織*浸入異戊烷之后，使組織在異戊烷中浸幾秒鐘，然后再放置干冰上 1分鐘以確保組織能很好地冰凍。進(jìn)行切片之前不要讓組織融化。

l 切片機(jī)的型號(hào)可能會(huì)有不同，但所用的型號(hào)確保能切厚的切片（比如 100 um）。

l     如果冰凍切片機(jī)只有一個(gè)溫度設(shè)置，那么在進(jìn)行切片之前把溫度設(shè)置在-22℃ 至少 4 個(gè)小時(shí)。如果有兩個(gè)溫度設(shè)置，那么設(shè)置槽內(nèi)溫度比樣本溫度低 1℃。 請(qǐng)注意大多數(shù)情況下-22℃是zui佳的溫度，然而，為了更順利地切出切片并 沒有破碎，不同型號(hào)的切片機(jī)和不同的組織可能需要更高或更低的槽內(nèi)溫 度。

l 對(duì)于用冰凍切片機(jī)切片，以下幾點(diǎn)提示是有益的：1）用蒸餾水把組織固定 于樣本盤上，但必須確保組織沒有融化（可以在干冰上完成）。組織可以被 固定在任何類型的組織冰凍介質(zhì)上包括 OCT，但要避免切斷介質(zhì)。不要在 OCT 中包埋組織，如果組織確實(shí)需要包埋，用 TFM 替代 OCT。2）組織固定 到樣本盤后，放置組織于干冰上 10 分鐘，然后立即把固定有樣本的樣本盤安裝到冰凍切片機(jī)上，等 5 分鐘之后進(jìn)行切片。3）切好的一些切片（不要 使用防卷板），如果組織溫度過低比如切片顯示出與刀片平行的裂縫，先等 幾分鐘再進(jìn)行下一個(gè)切片，否則可繼續(xù)切。

l  浸泡的腦可用瓊脂糖或明膠包埋然后用冰凍切片機(jī)切片。然而收集切片時(shí)（充滿切片槽），必須使用溶液 C。否則切片易干燥裂紋。

l  如果用滑動(dòng)切片機(jī)切浸泡的組織，樣本盤和刀片都需維持在較低的溫度（0℃ 以下）按照操作手冊(cè)的描述切片固定在含有溶液 C 的載玻片上是重要的。

VI.    染色步驟

在染色過程中和蓋蓋玻片之前的任何一步都不要讓切片變干

1.    用雙蒸水或 Milli-Q 水沖洗切片兩次，每次 4 分鐘。

2.    把切片置于由 1 份溶液 D，1 份溶液 E 和 2 份的雙蒸水或 Milli-Q 水組成的混合液 中 10 分鐘。

比如：

溶液 D          10ml

溶液 E     10ml

雙蒸水    20ml

注意

l  工作液zui好現(xiàn)配現(xiàn)用，每 100ml 工作液zui多用于 100 張切片（比如小鼠腦）， 根據(jù)切片的大小。

l  盛有工作液的瓶子或染色罐必須蓋好蓋子防止試劑蒸發(fā)。

l  為取得zui佳結(jié)果，孵育期間應(yīng)頻繁攪拌工作液。

3.    用蒸餾水或 Milli-Q 水沖洗切片兩次，每次 4 分鐘（蒸餾水應(yīng)頻繁更換新的）。

4.    用結(jié)晶紫或硫堇對(duì)切片進(jìn)行復(fù)染（可選步驟）。

注意

l  對(duì)于復(fù)染，延長(zhǎng)步驟 3 的時(shí)間，比如用沖洗 4 次每次 5 分鐘代替原來的沖洗2 次每次 4 分鐘，或者更長(zhǎng)的時(shí)間。

5.    在 50%，75%和 95%的乙醇中對(duì)切片進(jìn)行脫水，每個(gè)濃度梯度脫水 4 分鐘（不要 跳過任何一個(gè)步驟）。

6.    然后在無水乙醇中對(duì)切片進(jìn)行脫水，4 次，每次 4 分鐘（不要延長(zhǎng)時(shí)間）。

7.    在二甲苯中透明，3 次，每次 4 分鐘，并且用樹脂封片劑對(duì)蓋玻片進(jìn)行封片。

注意

l  蓋玻片之前切片可以暫時(shí)存于二甲苯中幾個(gè)小時(shí)。

l  為取得zui佳結(jié)果，zui好用未稀釋的封片劑。

l  用 Golgi 染色的切片無論何時(shí)都應(yīng)避光保存。